Organik çözücülere dirençli lipaz üreten bakterilerin topraktan izolasyonu ve enzimin karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada çeşitli topraklardan izole edilen 30 bakteri izolatının ekstraselüler lipaz üretim kapasiteleri test edilmiştir. En iyi lipaz üreticisi olarak B5 izolatı seçilmiştir. İzolatın tanılaması 16S rRNA gen bölgesine göre yapılmış ve Gen Bankası'ndaki baz dizisi çakışmasına göre Burkholderia cenocepacia olarak belirlenmiştir. Kantitatif ekstraselüler lipaz aktivitesi spektrofotometrik yöntemle ölçülmüştür ve 24 saat inkübasyon sonunda lipaz aktivitesi 7.59 U/mL, spesifik aktivitesi ise 263.16 U/mg olarak bulunmuştur. B. cenocepacia B5 lipazının molekül kütlesi yaklaşık 30 kDa olarak tespit edilmiştir. Enzimin Michaelis-Menten kinetik sabitleri olan Km ve Vmaks değerleri sırasıyla 0.072 mM ve 263.16 U/mg olarak tespit edilmiştir. Enzimin 30-60 °C ve pH 5.0-10.0 arasında aktif olduğu, optimum aktiviteyi 50 °C ve pH 10.0'da gösterdiği tespit edilmiştir. Enzim, en yüksek aktiviteyi substrat olarak p-nitrofenil palmitatta göstermiştir. Metanol, etanol, 2-propanol, asetonitril ve aseton gibi organik çözücüler lipaz aktivitesinde artışa, DMSO ise azalmaya neden olmuştur. Bazı metal ve kimyasalların aktiviteyi arttırdığı (Al3+, EDTA) görülürken bazılarının (Tween 80, Cr3+) ise aktiviteyi azalttığı görülmüştür. B5 lipazının zeytinyağını yağ asitlerine parçaladığı ince tabaka kromotografisinde gösterilmiştir. B. cenocepacia B5 lipazının özellikleri incelendiğinde bu enzimin organik çözücülerde aktivitesinin iyi olması onun biyoteknolojik uygulamalar ve biyodizel üretiminde kullanılabileceğini göstermektedir. In this study, extracellular lipase production capacity of 30 bacteria, isolated from various soils, were tested. Isolate B5 was selected as the most lipase producer. Identification of the microorganism was done by its 16S rRNA gene sequencing and it was determined Burkholderia cenocepacia according to the GeneBank sequence comparison. Quantitative extracellular lipase activity was determined spectrophotomertrically and the maximum lipase activity was observed with 7.59 U/mL at 24 hours and the spesific activity was found 263.16 U/mg. The molecular mass of lipase enzyme was observed approximately 30 kDa with SDS-PAGE. Michaelis-Menten kinetic constant Km and Vmax values of B. cenocepacia B5 lipase were determined as 0.072 mM and 263.16 U/mg, respectively. It was observed the lipase was active at pH range of 5.0-10.0 and temperature on 30-60 °C, the optimum pH of the lipase was 10.00 and optimum temperature was 50 °C. The enzyme showed the highest lipase activity when p-nitrophenyl palmitate used as a substrate. Organic solvents such as methanol, ethanol, 2-propanol, acetonitrile, and acetone cause an increase in lipase activity but DMSO cause decrease. Some metals and chemicals increased activity (Al3+, EDTA), whereas some were found to inhibit the activity (Tween 80, Cr3+). It was displayed that lipase enzyme broke down the olive oil into fatty acids by thin-layer chromatography. It was concluded that the enzyme can be used in biotechnological applications and biodiesel production due to good activity in organic solvents when the characteristics of B.cenocepacia B5 lipase was investigated.