Termofilik Anoxybacillus flavithermus bakterisinin ısıl kararlı β-glukozidaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve biyokimyasal karakterizasyonu

Abstract

Dünyada bol bulunan ve yenilenebilir enerji kaynağı olan selülozun yıkımında da rol oynayan enzimlerden biri olan ß-glukozidazlar (3.2.1.21), oligosakkaritlerin yapısında bulunan ß-glukosidik bağların hidrolizinden sorumludur. Bu çalışmada, termofilik Anoxybacillus flavithermus bakterisine ait ß-glukozidaz geni PZR ile saptanarak klonlanmış ve E.coli'de eksprese edilerek biyokimyasal karakterizasyonu amaçlanmıştır. Afbgl geni PZR ile yakalanarak Pet100 Directional TOPO Expression kit ile E.coli BL21Star (DE3) hücresinde eksprese edilmiştir. Sonrasında ısı çöktürmesi ve Ni+2 afinite kromatografisi yöntemleriyle saflaştırılmıştır. SDS-PAGE analizinde enzimin 53 kDa olduğu, optimum çalışma sıcaklığının 65ºC, optimum pH'sı 6,8 olarak bulunmuştur. Beta-glukosidaz enziminin substrat spesifikliği pNPG, pNPC, pNPX ve oNPG substratları kullanılarak belirlenmistir. Enzimin substratı olan p-nitrofenil ß-glukozid ile yapılan kinetik denemelerde Vmax değerinin ß-glukozidaz 5,13 x 105 µmol/dak/mg protein, Km değerinin ise 422,3 µM olduğu belirlenmiştir. Doğada sık karşılaşılan ağır metallerden K, Fe, Mn, Al, Mg, Zn ve Cu'nun saflaştırılmış ß-glukosidaz enzim aktivitesi üzerine in vitro etkileri araştırılmıştır. Bu ağır metallerden Mg'un enzim aktivitesi üzerinde aktivasyon etkisi gösterdiği belirlenmistir. Ancak Cu, Zn, Al, Mn, Fe ve K ağır metallerinin ise enzim aktivitesi üzerinde inhibisyon etkisi gösterdiği tespit edilmistir. Anahtar Kelimeler: Anoxybacillus flavithermus, ß-glukozidaz, termofilik enzim, pNPG, E.coli ß-glucosidases (3.2.1.21) hydrolyse celluse which is the most abundant and renewable source of energy on Earth. Also this enzyme completes the hydrolysis by converting cellobiose and cello-oligosaccaharides into glucose monomers. In this study, we aimed to clone, expression, and biochemical characterization of thermophilic ß- glucosidase gene from thermophilic bacterium, Anoxybacillus flavithermus. The gene was cloned, sequenced, and expressed in E.coli Afbgl was cloned and overexpressed in E.coli BL21 Star (DE3) host cells with Pet100 Directional TOPO Expession Kit. Then, we purified to homogenity by heat precipitation and Ni+2 affinity chromatography. The molecular mass of the recombinant enzyme was 53 kDa. The optimum temperature and ph of the purified enzyme were 65 ºC and 6,8, respectively. The specifity of beta-glucosidase enzyme was determined used pNPG, pNPC, pNPX and oNPG sustrates. At these points, the enzyme had 5,13 x 105 µmol/dak/mg protein Vmax and 422,3 µM of Km towards p-nitrophenyl ß-D-glucoside. The effects of K+, Fe+2, Mn+2,Mg+2, Zn+2, Cu+2 and Al+3, and which are commonly seen heavy metals in the nature on purified beta-glucosidase enzyme was investigated in vitro. It was determined that from this heavy metals Mg+2 has affected as activation on ezyme activity. However, it was determined that the other heavy metals K+, Cu+2, Zn+2, Mn+2, Fe+2 and Al+3have inhbition effects on enzyme activity. Keyword: Anoxybacillus flavithermus, ß-glucosidase, thermophilic enzyme, pNPG, E.Coli.