Anoxybacillus flavithermus bakterisinin ısıl kararlı guanozintrifosfat siklohidrolaz-I geninin klonlanması ve ekspresyonu

Abstract

Bu çalışma, termofilik orjinli Anoxybacillus flavithermus bakterisine ait guanozin trifosfat siklohidrolaz I enziminin karakterizasyonunu içermektedir. Klonlanan gchI geni 603 baz çifti büyüklüğünde toplam 200 amino asidi kodlayan tek bir açık okuma dizinidir. GTP?den dihidroneopterin trifosfat dönüşümünü katalizler. Enzim ekspresyonu pET28a(+) vektörüne klonlandıktan sonra E. coli BL21(DE3)pLysS hücresinde 1 mM IPTG indüksiyonu ile tamamlanmış, saflaştırılması için 6xHis kuyruğuna özel Ni-NTA kolonu kullanılmıştır. Yapılan karakterizasyon sonucunda enzimin 24 kDa büyüklüğünde olduğu SDS-PAGE analizi ve amino asit sekansı hesaplamaları doğrulanmıştır. Enzim en iyi aktivite gösterdiği sıcaklık değeri 65?C ve en uygun pH değeri ise 8,0 olarak belirlendi. Enzime ait kinetik verilere bakıldığında, Vmax?ı 100,93 ± 3,5 nM/dak/mg protein ve Km?si 243 ± 23,25 ?M olarak bulundu. Anahtar Kelimeler: Anoxybacillus flavithermus, GTP, GTP siklohidrolaz I, enzim karakterizasyonu. This study was included the characterization of guanosin triphosphate cyclohydrolase I from thermophilic bacteria, Anoxybacillus flavithermus. We cloned the gchI gene that was 603 bp and its open reading frame has 200 amino acids. This enzyme catalyzed from GTP to dihydroneopterin triphosphate. We cloned into pET28a(+) expression vector with 6xHis tags and transform in E. coli BL21(DE3)pLysS host cells to express with 1 mM IPTG induction. We purified the enzyme with Ni-NTA resin. We determined that GCH-I is 24 kDa, its optimum pH is 8.0 and temperature is 65?C. Under optimal conditions, GCH-I exhibited a low enzymatic activity with Km- and Vmax- values of 243 ± 23,25 ?M and 100,93 ± 3,5 nM/min/mg protein, respectively. Key Words: Anoxybacillus flavithermus, GTP, GTP cyclohydrolase I, enzyme characterization.