Anoxybacillus flavithermus WK1 AfCDA geninin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve biyokimyasal karakteriasyonu

Abstract

Karbohidrat esteraz 4 ailesi kitin, asetil ksilan ve peptidoglikan gibi polimerik substratları deasetile ederler. Son zamanlarda bu enzimlerden bazıları enzimolojik olarak karakterize edilmiştir. Termofilik bakterilerden ise bu aileye ait enzimlerle yapılmış sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu ailenin tüm üyeleri NodB'ye homolog domain adı verilen ortak korunmuş bir domain içermeleri ile karakterize edilirler.Termofilik Anoxybacillus flavithermus WK1 bakterisi genom projesi 2008 yılında tamamlanmıştır. Tüm genom karbonhidrat deasetilaz aday genleri için tarandığında iki adet gen belirlenmiştir. Bunlardan bir tanesi 762 baz çifti uzunluğuna sahiptir ve 253 amino asitlik bir protein kodlamaktadır. Bu gen, standart PZR primerleri ile çoğaltılarak histidin kuyruk içerecek şekilde pET-15b ekspresyon vektörünün NdeI bölgesine klonlandı. Rekombinant plazmit E. coli (Escherichia coli) BL21 (DE3)pLysS ekspresyon hücrelerine transforme edilerek ekspres edildi. Rekombinant protein Ni-afinite kromotografisi kullanılarak saflaştırıldı ve saflığı Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile belirlendi. Enzim aktivitesi için substrat olarak ?-naftil asetat kullanıldı ve aktivite SDS-PAGE'de Fast Red boyaması ile gösterildi. AfCDA proteininin biyokimyasal özellikleri spektrofotometrik yöntemle kromojenik substrat olarak p-nitrofenil asetat kullanılarak belirlendi. Optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 50 °C ve optimum pH değeri 7,5 olarak belirlendi. Kinetik karakterizasyon çalışmalar substrat olarak p-nitrofenil asetat kullanılarak araştırıldı ve Km değeri 4,33 µM, Vmaks değeri ise 3333,33 U/mg olarak hesaplandı.Anoxybacillus flavithermus WK1 geninin nükleotid ve aminoasit dizilimi kullanılarak diğer türlerle olan akrabalık dereceleri incelendi. Filogenetik dendogramda A. flavithermus WK1 bakterisinin diğer Bacillus türlerinden açıkça ayrıldığı gözlendi. afcda geni aminoasit sırası, CE-4 ailesinin bilinen üyelerinin aminoasit sıraları karşılaştırılarak ClustalW programı ile korunmuş motifleri bulmak için kullanıldı. Toplam beş motiften dördünün korunmuş olduğu ve motif 2'nin ise tamamen farklı olduğu belirlendi.Anoxybacillus flavithermus WK1 AfCDA enziminin her hangi bir metal iyonuna bağımlı olmadan aktivite gösterdiği belirlendi. Family 4 carbohydrate esterases deacetylate polymeric carbohydrate substrates such as chitin, acetyl xylan and peptidoglycan. Although some of these enzymes have recently been enzymologically characterized, they have been limited number of study thermophilic bacteria. All members of this enzyme family have a characteristic homolog domain into NodB.The genome project of Anoxybacillus flavithermus WK1 was determined in 2008. When the all genome was screened for carbohydrate deacetylase gene, two genes were determined as candidate. One of these genes is 762 bp long and encodes a protein of 252 aminoacids in length. This gene was amplified by standard PCR to clone into NdeI site of pET-15b expression vector to express with six histidine residues. Recombinant plasmid was transformed into E. coli (Escherichia coli) BL21 (DE3)pLysS cell and expressed. The recombinant protein was purified by nickel affinity chromatography and its purity was visualized on SDS-PAGE. Activity of recombinant enzyme was shown on SDS-PAGE by using ?-naphtyl acetate as a substrate and Fast Red. The enzyme was characterized by spectrophotometrically using chromogenic substrate-p-nitrophenyl acetate. Optimum temperature and pH were determined 50 °C and 7.5 respectively. Km and Vmax were determined 4,33 µM and 3333,33 U/mg respectively.Phylogenetic similarity of Anoxybacillus flavithermus WK1 to other species was investigated by using nucleotide and amino acids sequences. Phylogenetic dendogram clearly demonstrated that Anoxybacillus flavithermus WK1 is different from the other species. afcda gene aminoacid sequences were used to find conserved motifs with comparison of other known members of CE-4 family . Five conserved motifs were investigated and all motifs were found as conserved except motif 2.It was shown that the AfCDA enzyme from Anoxybacillus flavithermus WK1 does not need any metal ions to show activity.