Anoxybacillus gonensis G2T CTP sentetaz geninin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve amonyak-bağımlı CTP sentetaz aktivitesinin karakterizasyonu

Abstract

Sitidin 5'-trifosfat sentetaz (CTPs) primidin metabolizmasında son basamağı katalizleyen enzimdir. CTPs, ATP tarafından aktifleştirilen UTP'ye amino grubunu aktararak CTP oluşumunu katalizler. Nükleotid biyosentezinin bölünen hücrelerdeki öneminden dolayı CTPs anti-tümöral, anti-parazitik ilaçlar için hedeftir. Bu enzimin moleküler ve biyokimyasal özelliklerinin bilinmesi yeni ilaçların geliştirilmesi açısından önemlidir. Bakterilere ve insana ait CTPs yapısal olarak oldukça benzerdir. Bakterilere ait CTPs ile yapılan çalışmalar, insanlara ait CTPs ile yapılacak çalışmalara ışık tutacaktır.Bu çalışmada termofilik Anoxybacillus gonensis G2T (Agon) bakterisinin ctp sentetaz geni (pyrG) ürünü biyokimyasal olarak karakterize edildi ve nükleotid ve amino asit benzerliklerinden yararlanılarak akrabalık dereceleri incelendi. Bu amaç doğrultusunda; (1) Agon genomik DNA'sı izole edildi ve EcoRI enzimi ile oluşturulan genomik kütüphaneden shotgun tekniği kullanılarak pyrG gen sırası bulundu, (2) elde edilen nükleotid diziliminden yararlanılarak hem nükleotid hemde aminoasit verileri kullanılarak benzerlik ağaçları oluşturuldu, (3) pyrG geni pET-15b vektörüne klonlandı ve E. coli (Escherichia coli) BL21 (DE3)pLysS hücrelerine transforme edilerek ekspres edilmesi sağlandı, (4) rekombiant olarak üretilen protein MagneHis Purifikasyon Kiti kullanılarak saflaştırıldı ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) saflığı belirlendi (5) pyrG genine ait proteinin biyokimyasal özellikleri spektrofotometrik olarak belirlendi. Sonuç olarak enzimin aktivite gösterdiği optimum sıcaklık 650C ve optimum pH'sının 9 olduğu belirlendi. Enzimin aktivitesinin 650 C ve yukarısındaki ısı uygulamalarında azaldığı bulundu. Km değeri yaklaşık 12,415 mM ve Vmax değeri yaklaşık 0,381 U/L olarak hesaplandı. kcat değeri ise yaklaşık 0,762 s-1 olarak hesaplandı. Benzerlik ağaçlarında ise Agon bakterisinin en fazla Anoxybacillus flavithermus bakterisine benzer olduğu gözlendi. Cytidine 5'-triphosphate synthetase (CTPs) catalyzes the last step in the pyrimidine metabolism. In that reaction, UTP was activated by ATP and used for CTP synthesis by CTPs. Because of the importance of nucleotide biosynthesis in dividing cells, CTPs is a goal for anti-tumor and anti-parasitic drugs. Knowledge of the molecular and biochemical properties of this enzyme is important for the development of new drugs. Cytidine 5'-triphosphate synthetase (CTPs) of bacteria and human are structurally very similar to each other. Studies done with bacteria will shed light on future studies about humans CTPs.In this study, ctp synthetase gene (pyrG) product was biochemically characterized from thermophilic Anoxybacillus gonensis G2T (Agon) and its nucleotid sequence was used to investigate the genetic similarity. For this purpose; (1) genomic DNA was isolated from Agon and cutted by EcoRI enzyme to generate genomic library. pyrG gene sequences was idendified with shotgun method using this library. (2) The genetic similarity was generated by using both nucleotide and amino acid sequences. (3) pyrG gene was cloned into pET-15b expression vector and protein was expressed in E. coli (Escherichia coli) BL21 (DE3)pLysS strain. (4) The recombinant protein was purified with using MagneHis Purification System (Promega) and its purity was proved with sodium-dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). (5) The pure enzyme was biochemically characterized by spectrophotometrically. We found that enzyme has optimum activity at 65 0C and pH:9.0 and it lost its activity after 65 0C. Km and Vmax were calculated approximately 12,415 mM, 0,381 U/L respectively. Kcat value was calculated approximately 0,762 s-1. The similarity trees showed that Agon and Anoxybacillus flavithermus were similar to each order much more than the other species.