Karbapeneme dirençli acinetobacter baumannii klinik izolatlarının moleküler epidemiyoloji açısından araştırılmasında üç farklı yöntemin karşılaştırılması

Abstract

Bu çalışmada, karbapenem dirençli oksasilinaz tipi karbapenemaz genlerini taşıyan Acinetobacter baumannii izolatlarının “uluslararası yüksek riskli klonlar” (IC I, II ve III) ile ilişkisinin farklı moleküler epidemiyolojik yöntemlerle değerlendirilmesi ve yöntemlerin uyum ve ayrım gücünün istatistiksel olarak karşılaştırılması amaçlanmıştır. Yetmiş iki hastanın tekrar etmeyen kan kültürlerinden izole edilen, karbapenem dirençli ve orta duyarlı 72 A.baumannii izolatı çalışmaya dahil edilmiştir. İzolatlarda OXA-tipi karbapenemaz genlerinden blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 ve blaOXA-58 varlığı polimeraz zincir reaksiyonu [polymerase chain reaction (PCR)] ile tespit edilip, DNA dizi analizi yöntemiyle doğrulanmıştır. Klinik izolatlarla birlikte IC I, II ve III klonları ‘pulsed field’ jel elektroforezi [pulsed field gel electrophoresis (PFGE)], multilokus dizi tiplendirmesi [multilocus sequence typing (MLST)] ve matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi [matrix-assisted laser desorption/ionization time- of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)] analiziyle tiplendirilmiştir. Yöntemlerin istatistiksel olarak karşılaştırması yapılırken Simpson’ın çeşitlilik indeksi [Simpson’s index of diversity (SID)] ile ayrım gücü, “Wallace katsayısı” ile uyumu değerlendirilmiştir. İzolatların tümünde blaOXA-23 ve blaOXA-51 genlerinin bulunduğu saptanmıştır. Dizi analizi için seçilen dört izolatın biyoinformatik analizi sonucunda; blaOXA-23 ve blaOXA-51 genleri seçilen izolatlarda saptanmış olup, blaOXA-51 geni taşıyan iki izolatın blaOXA-92 geniyle %99 oranında benzerlik gösterdiği saptanmıştır. İzolatlar, PFGE ile ≥ %85 benzerlik katsayısına göre beş pulsotipe (A, B, C, D ve E) ayrılmıştır. İzolatlar ve sırasıyla ICI, ICII ve ICIII yüksek riskli klonlarına ait RUH 875, RUH 134, LUH 5875 suşları PFGE ile; A (n= 58), B (n= 8), C (n= 4), D (n= 4) ve E (n= 1) olmak üzere beş ana gruba ve bu gruplar da 10 alt gruba (A1, A2, A4, A5, A6, A9, B1, B4, C3, D1) ayrılmıştır. IC klon III (E1) ve yedi izolat özgül (A3, A7, A8, B2, B3, C1, C2) PFGE profili göstermiştir. ICII A5 alt tipinde; ICI C1 alt tipinde ve ICIII E1 alt tipinde yer almıştır. PFGE alt tip grupları ile 18 pulsotip belirlenmiş ve pulsotiplerden rastgele seçilen 20 izolatta, MLST Pasteur şemasına (cpn60, fusA, gltA, pyrG, recA, rplB, rpoB) göre; ST1, ST2, ST81, ST157 ve ST604 sekans tipleri bulunmuştur. MALDI-TOF MS ile 72 A.baumannii izolatı ve ICI, ICII ve ICIII klonlarının cihazda oluşturulan spektra ölçümlerinin “temel bileşen analizi (PCA)” yapılmıştır. PCA analizinde kümelenme mesafe düzeyi 1.5 olarak hesaplanmış, izolatlar üç kümeye ayrılmıştır. IC klon I, II ve III ile klinik izolatların 70’i bir kümede toplanırken, iki klinik izolat (AB083 ve AB0115) tekli kümeler oluşturmuştur. MALDI-TOF MS, MLST ve PFGE verileri arasında Wallace katsayısına göre anlamlı bir uyum görülmemiştir. PFGE yönteminin SID katsayısı ile ayrım gücü bakımından anlamlı sonuç verdiği, MALDI-TOF MS PCA analizinin ise ayrım gücünün en düşük değere sahip olduğu, PFGE’nin MLST ile Wallace katsayısı sonucunun ise uyumlu olduğu bulunmuştur. Sonuçlarımız, A.baumannii türlerinde epidemiyolojik analiz için MALDI-TOF MS’nin, PFGE ve MLST gibi altın standart bir yöntem olarak işlev göremeyeceğini ve MALDI-TOF MS için kullanılan epidemiyolojik tiplendirme protokollerinin iyileştirilmesi ve geliştirilmesi gerektiğini göstermiştir

The aim of the study was to evaluate the relationship between carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii isolates carrying oxacillinase-type carbapenemase genes with “international high-risk clones” (IC I, II, and III) by different molecular epidemiological methods and to statistically compare the concordance and discrimination power of the methods. Carbapenem-resistant and moderately susceptible A.baumannii isolates from non-repeating blood cultures of 72 patients were included in the study. The presence of “blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 ve blaOXA-58” genes within OXA-type carbapenemases was detected by polymerase chain reaction (PCR) method and confirmed by DNA sequence analysis. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST) and matrix-assisted laser desorption/ ionization time- of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analyses were performed to evaluate the clonal relations of IC I, II and III clones together with clinical isolates. In the statistical comparison of the methods, discrimination power was evaluated by Simpson index of diversity (SID) and concordance by “Wallace coefficient”. All of the isolates were found to carry blaOXA-23 and blaOXA-51 genes. As a result of the bioinformatic analysis of the four isolates selected for sequence analysis; blaOXA-23 and blaOXA-51 genes were detected in the selected isolates, and the analysis of two isolates carrying blaOXA-51 gene showed 99% similarity with blaOXA-92 gene. The isolates were clustered into five pulsotypes (A, B, C, D and E) according to ≥ 85% similarity coefficient by PFGE. The isolates and RUH 875, RUH 134, LUH 5875 strains belonging to high-risk clones ICI, ICII and ICIII, respectively, were divided into five main groups [A (n= 58), B (n= 8), C (n= 4), D (n= 4) and E (n= 1)] and 10 subgroups (A1, A2, A4, A5, A6, A9, B1, B4, C3, D1) by PFGE. IC clone III (E1) and seven strains showed singleton PFGE profiles (A3, A7, A8, B2, B3, C1, C2). ICII was found in A5 subtype, ICI in C1 subtype and ICIII in E1 subtype. By PFGE subtype groups, 18 pulsotypes were determined and ST1, ST2, ST81, ST157 and ST604 sequence types were found in 20 isolates randomly selected from pulsotypes according to MLST Pasteur scheme (cpn60, fusA, gltA, pyrG, recA, rplB, rpoB). Principal component analysis (PCA) of the spectra of 72 A. baumannii isolates and ICI, ICII and ICIII clones was performed by MALDI-TOF MS. In PCA analysis, the cluster distance level was defined as 1.5 and the isolates were divided into three clusters. IC clone I, II and III together with 70 clinical isolates were grouped in one cluster, while two clinical isolates (AB083 and AB0115) formed singleton clusters. There was no significant agreement between MALDI-TOF MS; MLST and PFGE data according to Wallace coefficient. It was found that PFGE method gave significant results in terms of discrimination power with SID coefficient, MALDI-TOF MS PCA analysis had the lowest discrimination power value, and the Wallace coefficient result of PFGE and MLST was concordant. In conclusion, MALDI-TOF MS may not function as a gold standard method like PFGE and MLST for epidemiological analysis in A.baumannii species and the epidemiological typing protocols used for MALDI-TOF MS need to be improved and developed.